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硅膠柱層析

硅膠柱層析

  硅膠柱層析原理

  硅膠層析法的分離原理是根據物質在硅膠上的吸附力不同而得到分離, 一般情況下極性較大的物質易被硅膠吸附,極性較弱的物質不易被硅膠吸附,整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程。

  硅膠柱層析流動相

  極性小的用乙酸乙酯:石油醚系統;極性較大的用甲醇:氯仿系統;極性大的用甲醇:水:正丁醇:醋酸系統;拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸

  硅膠柱層析慣用方法

  1.稱量。200-300目硅膠,稱30-70倍于上樣量;如果極難分,也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右,所以要稱40g硅膠,用燒杯量100ml也可以。

  2.攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分攪拌。如果洗脫劑是石油醚/乙酸乙酯/丙酮體系,就用石油醚拌;如果洗脫劑是氯仿/醇體系,就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿,說明溶劑中含水量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,如果不與水配伍走分配色譜的話,必須預先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥,以除去1%的醇。如果樣品對酸敏感,不能用氯仿體系過柱。

  3.裝柱。將柱底用棉花塞緊,不必用海沙,加入約1/3體積石油醚(氯仿),裝上蓄液球,打開柱下活塞,將勻漿一次傾入蓄液球內。隨著沉降,會有一些硅膠沾在蓄液球內,用石油醚(氯仿)將其沖入柱中。

  4。壓實。沉降完成后,加入更多的石油醚,用雙聯球或氣泵加壓,直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱,都應進行這一步,可使分離度提高很多,且可以避免過柱時由于柱床萎縮產生開裂。

  5.上樣。干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后,加入一些洗脫劑,再將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑,而不會沖壞硅膠表面。

  6。過柱和收集。柱層析實際上是在擴散和分離之間的權衡。太低的洗脫強度并不好,推薦用梯度洗脫。收集的例子:10mg上樣量,1g硅膠H,0。5ml收一餾分;1-2g上樣量,50g硅膠(200-300目),20-50ml收一餾分。

  7.檢測。要更多地使用專用噴顯劑,如果僅用紫外燈,會損失較多產品,紫外的靈敏度一般比噴顯劑底1-2個數量級。

8。送譜。收集的產品旋干,在送譜前通常需要重結晶。如果樣品太少或為液體,可過一小凝膠柱,作為送譜前的最后純化手段。可除去氫譜1。5ppm左右所謂的“硅膠”峰

硅膠柱清洗方法

正相的我們一般都只使用一次,反相的才反復使用。

在做實驗時我們用硅膠裝的玻璃柱在使用時一般都是一次性的,但如應用至規模化生產時這樣的操作不免很浪費,可以想像,一根裝有接近200kg硅膠填料的柱子在使用一次后就扔掉的壯觀景象。當然,重復使用的情況一般在物料純度較高,色素很少的情況下才能實現。我們曾經嘗試過裝好的柱子(180kg填料)可以重復使用近12次,而且在使用的過程中,第一次的效果并不是最好的,從第二次開始到后來層析的效果比較穩定,效果也不錯,然后是有一個緩慢下降的趨勢,到最后不能使用卻是突然性的。

如果物料純度確實太差,那也沒辦法,只能將用過的硅膠拿去再生后重復使用了。

硅膠在使用過程中因吸附了介質中的水蒸汽或其他有機物質,吸附能力下降,可通過再生后重復使用。

一、硅膠吸附水蒸汽后的再生

 硅膠吸附水份后,可通過熱脫附方式將水份除去,加熱的方式有多種,如電熱爐、煙道余熱加熱及熱風干燥等。

 脫附加熱的溫度控制在120--180為宜,對于藍膠指示劑、變色硅膠、DL型藍色硅膠則控制在100--120為宜。各種工業硅膠再生時的最高溫度不應超過以下限度:

   粗孔硅膠不得高于600

   細孔硅膠不得高于200

   藍膠指標劑(或變色硅膠)不得高于120

   硅鋁膠不得高于350

 再生后的硅膠,其水份一般控制在2%以下即可重新投入使用。

二、硅膠吸附有機雜質后的再生

  焙燒法

 對于粗孔硅膠,可放在焙燒爐內逐漸升溫至500--600,約經6—8小時至膠粒呈白色或黃褐色即可。對細孔硅膠,焙燒溫度不能超過200。

  漂洗法

  將硅膠在飽和水蒸汽中吸附達到飽和后放熱水中浸泡漂洗,并可結合使用洗滌劑以除去廢油或其它有機雜質,再經凈水洗滌后烘干脫水。

  溶劑沖洗法

  根據硅膠吸附有機物種類,選用適當的溶劑將吸附在硅膠內的有機物溶出,然后將硅膠加熱以脫除溶劑。

三、硅膠再生應注意的問題

  烘干再生時應注意掌握逐漸提高溫度,以免劇烈干燥引起膠粒炸裂,降低回收率。

  對硅膠焙燒再生時,溫度過高會引起硅膠孔結構的變化而明顯降低其吸附效果,影響使用價值。對于藍膠指示劑或變色硅膠,脫附再生的溫度應不超過120,否則會因顯色劑逐步氧化而失去顯色作用。

 ⒊ 經再生后的硅膠一般應過篩除去微細顆粒,以使顆粒均勻。

正相、反相和極性膠聯柱使用手冊

Chrompack HPLC Normal-,Reversed phase and Polar bonded columns
注意
此色譜柱填充的是改性硅膠材料。向柱內導入堿性溶劑(pH>7。0)或酸性溶劑(pH<2。0)會導致柱子損壞。在使用這個柱子之前,你要充分地熟悉這本手冊講述的內容。未正確地使用不能享受保修待遇。
                      1. 簡介

此柱填充的是反相或者極性膠聯型態的硅膠基質材料的硅膠。硅膠形態的柱子用于正相(非水)條件。
反相(C8,C18,ODS,RP-8和RP-18)通常用于反相條件(水相)。
極性膠聯型(APS,diol,CN和NH2)依照應用目的,可以用于正相和反相條件。建議不要將一個相同的柱子用于差別非常大的條件下,這是因為柱子在特定的條件下,固定相的性質會發生變化,所以在其他的條件下,會影響柱效。也不建議將硅膠柱用在反相條件下或者將方向柱用在正相條件下,這是因為這種過程會發生重復性差的問題(每一次注射之間和柱與柱之間的比較)。
2.  色譜柱老化
在開始分析工作以前,柱子必須經過正確的老化。一個沒有正確老化的柱子可能會帶來問題,諸如很差的柱效或者分離情況發生變化等等。
A.在反相條件下老化
要老化這類柱子,首先要使用乙腈或者甲醇淋洗,然后你選用的洗脫液進行平衡。
在發貨以前,每根柱子都已經測試過并進行了老化。因此沒有必要在第一次使用時用水沖洗)。
如果流動相中使用了添加物(例如緩沖液或離子對試劑),建議使用正確比例的但不含此添加物的流動相進行緩沖沖洗。緩沖沖洗應當首先以低流速進行,最后再使用正常流速。
B.在正相條件下老化
柱效可能會受水與固定相的鍵合的嚴重影響。柱子的干燥(激活)或潤濕(失活)可能是需要的。使用的溶劑可能是水飽和的或者是無水的。干燥柱子可以使用無水的二氯甲烷。
C.對于極性鍵合柱的特殊說明
由于這些柱子可以用于反相或者正相條件,在進行老化以前,一定要首先檢查你要使用的淋洗溶劑或洗脫液是否可以與封裝在柱子里的溶劑相混溶。如果這些溶劑不能混溶,必須先使用一個合適的緩沖溶劑進行沖洗。

3.洗脫液

注意第節和第2節。一定不要使用pH低于2或者高于7的緩沖液,這是由于它們會改變固定相的性質。極性鍵合柱最好使用在3到5 之間。在使用以前,洗脫液要進行脫氣,以及使用0.5微米的濾膜過濾,以免發生檢測和泵送問題。

一定要在開始使用系統以前檢查水溶液中有否微生物生長,否則你的柱子會堵塞,柱壓會升高到無法接受的水平。
4. 流量和壓力
注意:最高壓力:不銹鋼柱:4500psi;玻璃柱:3000psi
增加流速或者降低流速要采取小的間隔變化以防止填充床的擾動。

如果你想更換柱子,,要降低流量至0,等待洗脫液完全流出柱子為止(2分鐘)。

拆除柱子而沒有等待壓力的降低會損壞柱子。

高柱壓的產生一般是由于不正確地使用柱子的結果。

使用保護柱(見第6節)會防止污染物沉積在分析柱上。
5.樣品準備

保持柱子長壽的關鍵是進樣前適當的的樣品處理。你必須防止將疏水性/與流動相極性差別很大的化合物泵入色譜柱,不管是來自流動相還是樣品。特別地,要禁止導入顆粒雜質。這些最終都會造成操作壓力的增高而且非常困難或者不可能去除。


6.保護柱

一定要使用保護柱,因為樣品和洗脫液污染可能會造成柱壓力的增高而且影響選擇性。對于ChromSep 柱我們建議使用正確型號的ChromSep 保護柱。這個柱子的填充材料與用于分析的色譜柱的材料相似。當柱壓增高的或者觀察到柱效降低的時候就需要更換保護柱了。對于常用不銹鋼柱,我們建議使用相同型號的Chromguard High Efficiency(高效)柱(10X3.0mm) 或High Capacity(高容量)柱(50X3.0mm)。


7.進樣量和濃度

柱子的最大載樣量取決于:柱子的型號,使用的條件和樣品的類型。很難給出一個一般的指示。

注射了太大體積或太濃的樣品會使峰展寬或者峰融合。

8.溫度

HPLC柱最好在柱溫箱中使用。重復性取決于溫度控制。最佳的溫度與特定的應用有關。溫度影響洗脫液流動的線速度。在使用ChromSep玻璃柱的時候,一定要調節流速使壓力保持在3000psi以下。


9.貯存

一定不要在柱子內充滿緩沖液或者其他含鹽類的洗脫液的情況下貯存色譜柱。 貯存溶劑應當含有至少20%的有機溶劑,以防止有細菌的生長。


10. 柱效損失的可能原因

1. 額外的峰展寬。當使用小直徑或者長度較短的柱子時,峰展寬的情況可能比較明顯。要保證管路的長度和內徑都保持最小。檢查進樣體積和檢測器檢查池體積是否適用于柱體積。

2. 洗脫的平衡時間不夠。

3. 不正確柱溫。

4. 不正確的修正濃度。

5. 床壓縮。使用了過大的洗脫流速。將柱子反向,使用低流速。
11。柱效喪失和/或高背壓

1.顆粒物積聚在燒結物或者樹脂床上(它們都會使背壓增高)。如果柱壓增高了,將柱子與進樣器斷開,運行泵,以驗證背壓的來源確實是來自柱子的顆粒污染(樣品、洗脫液和系統)。倒轉柱子,以反向的流動來沖洗柱子。如果這樣不能解決問題,更換進口過濾器或者篩板。

2.微生物在洗脫液中生長。倒轉柱子,嘗試以反向的流動來將污染物沖洗出柱子。更換進口過濾器或者篩板。

3.有蛋白質脂肪,油脂污染或者極性化合物等污染。再生柱子(見第12節)。
12.再生

1.再生反相色譜柱

a.首先倒轉柱子。

b. 以大約最佳流速的40%的流速沖洗柱子大約45-60分鐘,使用的溶劑的順序要按照水—甲醇—異丙醇—二氯甲烷—異丙醇—甲醇—水進行。

c. 柱子轉回正常方向,使用分析所用洗脫液平衡。

注意:在使用另外的淋洗方法的時候,一定要先用水開始沖洗以去除緩沖液,保證其后的洗脫液可以混溶。

2.再生硅膠柱

a.首先倒轉柱子。

b.以大約最佳流速的40%的流速沖洗柱子大約45-60分鐘,使用的溶劑的順序要按照異辛烷(或己烷)—乙酸乙酯—干燥的異辛烷(或己烷)進行。

c.柱子轉回正常方向,使用分析所用洗脫液平衡。

3.再生極性鍵合柱

取決于使用的條件,可以使用反相的條件,也可以使用硅膠柱的條件。

注意:絕對不要使用酮類或醛類沖洗氨基柱,因為可能與固定相發生反應。四氫呋喃作為替代可以使用。


作者: ruitao   發布日期: 2008-11-13

我用的普通硅膠的柱料,不是液相上的反相柱,感覺吸附的厲害,有顏色.請問怎么再生啊

硅膠柱層析慣用的方法:勻漿法。
1。稱量。200-300目硅膠,稱30-70倍于上樣量;如果極難分,也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右,所以要稱40g硅膠,用燒杯量100ml也可以。
2。攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分攪拌。如果洗脫劑是石油醚/乙酸乙酯/丙酮體系,就用石油醚拌;如果洗脫劑是氯仿/醇體系,就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿,說明溶劑中含水量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,如果不與水配伍走分配色譜的話,必須預先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥,以除去1%的醇。如果樣品對酸敏感,不能用氯仿體系過柱。
3。裝柱。將柱底用棉花塞緊,不必用海沙,加入約1/3體積石油醚(氯仿),裝上蓄液球,打開柱下活塞,將勻漿一次傾入蓄液球內。隨著沉降,會有一些硅膠沾在蓄液球內,用石油醚(氯仿)將其沖入柱中。
4。壓實。沉降完成后,加入更多的石油醚,用雙聯球或氣泵加壓,直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱,都應進行這一步,可使分離度提高很多,且可以避免過柱時由于柱床萎縮產生開裂。
5。上樣。干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后,加入一些洗脫劑,再將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑,而不會沖壞硅膠表面。
6。過柱和收集。柱層析實際上是在擴散和分離之間的權衡。太低的洗脫強度并不好,推薦用梯度洗脫。收集的例子:10mg上樣量,1g硅膠H,0.5ml收一餾分;1-2g上樣量,50g硅膠(200-300目),20-50ml收一餾分。
7。檢測。要更多地使用專用噴顯劑,如果僅用紫外燈,會損失較多產品,紫外的靈敏度一般比噴顯劑底1-2個數量級。
8。送譜。收集的產品旋干,在送譜前通常需要重結晶。如果樣品太少或為液體,可過一小凝膠柱,作為送譜前的最后純化手段。可除去氫譜1.5ppm左右所謂的“硅膠”峰。

1。先根據TLC方法篩選好洗脫劑,使兩相鄰物質Rf值之差最大化
2。將柱子必須裝平整、均勻
3。考慮有限柱填料的吸附量
4.可考慮用剃度法分開并洗脫

關于柱子的尺寸,應該是粗長的最好。

柱子長了,相應的塔板數就高。柱子粗了,上樣后樣品的原點就小(反映在柱子上就是
樣品層比較薄),這樣相對的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米,而樣品就有二
厘米,那么分離的難度可想而知,恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只
有0。5厘米,那么各組分就比較容易得到完全分離了。當然采用粗大的柱子要犧牲比較多
的硅膠和溶劑了,不過這些成本相對于產品來說也許就不算什么了(有些不環保的說,
不過溶劑回收重蒸后也就減小了部分浪費)。
現在見到的柱子徑高比一般在1:5~10,書中寫硅膠量是樣品量的30~40倍,具體的選
擇要具體分析。如果所需組分和雜質分的比較開(是指在所需組分rf在0.2~0.4,雜質
相差0.1以上),就可以少用硅膠,用小柱子(例如200毫克的樣品,用2cm×20cm的柱子
);如果相差不到0.1,就要加大柱子,我覺得可以增加柱子的直徑,比如用3cm的,也
可以減小淋洗劑的極性等等。

真空液相層析即vacuum liquid chromatography(VLC),即用真空代替壓力進行層析,具體方法可見Synthesis,2001,No,16,2431-,and J chem edu,1997,10,1222-
干法上樣,一般用于固體或粘度大的液體樣品。樣品用低沸點易溶溶劑溶解,加入1-3倍的粗硅膠,晾干或旋干,干燥的標準是硅膠成細粉而不粘在瓶壁上。裝好的柱子上留一段溶劑,把吸附了樣品的硅膠慢慢到進去,震動柱子或再加一些溶劑,把粘在柱壁上的硅膠洗下

常說的過柱子應該叫柱層析分離,也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相
的吸附柱。由于柱分的經驗成分太多,所以下面我就幾年來過柱的體會寫些心得,希望
能有所幫助。

柱子可以分為:加壓,常壓,減壓。
壓力可以增加淋洗劑的流動速度,減少產品收集的時間,但是會減低柱子的塔板數。所
以其他條件相同的時候,常壓柱是效率最高的,但是時間也最長,比如天然化合物的分
離,一個柱子幾個月也是有的。
減壓柱能夠減少硅膠的使用量,感覺能夠節省一半甚至更多,但是由于大量的空氣通過
硅膠會使溶劑揮發(有時在柱子外面有水汽凝結),以及有些比較易分解的東西可能得
不到,而且還必須同時使用水泵抽氣(很大的噪音,而且時間長)。以前曾經大量的過
減壓柱,對它有比較深厚的感情,但是自從嘗試了加壓后,就幾乎再也沒動過減壓的念
頭了。
加壓柱是一種比較好的方法,與常壓柱類似,只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力
的提供可以是壓縮空氣,雙連球或者小氣泵(給魚缸供氣的就行)。特別是在容易分解
的樣品的分離中適用。壓力不可過大,不然溶劑走的太快就會減低分離效果。個人覺得
加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。

關于無水無氧柱,適用于對氧,水敏感,易分解的產品。

可以濕柱,也可以干柱。不過在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和一次,因為溶劑和硅
膠飽和時放出的熱量有可能是產品分解,畢竟要分離的是敏感的東東,小心不為過。也
是因為分離的東西比較敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵循schlenk操作。至于是
加壓、常壓、減壓,隨需而定。因為是schlenk操作,所以點板是個問題,如果樣品是顯
色的,恭喜了,不用點板,直接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無色,只好準備幾十
個schlenk瓶,一瓶一瓶的點,不過幾次之后就知道樣品在哪,也就可以省些了。像我以
前過一根無水無氧柱,需要六個schlenk,現在只一個就能把所要的全收集到。
無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。因為硅膠中有大量的羥基裸露在外,
很容易是樣品分解,特別是金屬有機化合物和含磷化合物。而氧化鋁可以做成堿性、中
性和酸性的,選擇余地比較大,但是比硅膠要貴些。
聽說有個方法,就是用石英做柱子,然后用HF254做固定相,這樣在柱子外面用紫外燈一
照就知道產品在哪里了,沒有驗證過。哪位做過可以提出來大家參詳參詳。

關于濕法、干法上樣。

濕法省事,一般用淋洗劑溶解樣品,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶劑越少越好
,不然溶劑就成了淋洗劑了。
很多樣品在上柱前是粘乎乎的,一般沒關系。可是有的上樣后在硅膠上又會析出,這一
般都是比較大量的樣品才會出現,是因為硅膠對樣品的吸附飽和,而樣品本身又是比較
好的固體才會發生,這就應該先重結晶,得到大部分的產品后再柱分,如果不能重結晶
那就不管它了,直接過就是了,樣品隨著淋洗劑流動會溶解的。
有些樣品溶解性差,能溶解的溶劑又不能上柱(比如DMF,DMSO等,會隨著溶劑一起走,
顯色是一個很長的脫尾),這時就必須用干法上柱了。樣品和硅膠的量有一種說法是1:
1,我覺得是越少越好,但是要保證在旋干后,不能看到明顯的固體顆粒(那說明有的樣
品沒有吸附在硅膠上)。

溶劑的選擇。

當然是最便宜,最安全,最環保的了。所以大多選用石油醚,乙酸乙酯。文獻中有寫用
正己烷的,太貴了,除非特別需要不要用不然銀子嘩嘩的,流的比淋洗劑還快,不過因
為極性很小,有時還是非它不可。乙醚也可以用,但是就是容易睡覺,注意保持清醒別
讓溶劑流干了,那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的,但是要知道,它和硅膠的吸
附是一個放熱過程,所以夏天的時候經常會在柱子里產生氣泡,天氣冷的時候會好一些
。甲醇,據說能溶解部分的硅膠,所以產品如果想過元素分析的話要留神,應該經過后
繼處理,比如說重結晶等。其他的溶劑用的相對較少,要依個人的不同需要選擇了。
由于某些原因,用到的淋洗劑多是大包裝的(便宜嘛),我們這里是用10升或25升的塑
料桶裝的,就要注意這些工業品的純度是較低的。經常能夠從送來的大桶底部看見有色
的雜質,其他的雜質就可想而知了,所以在比較嚴格的柱分時就要對溶劑重蒸。當然過
原料時就可以免去這一步了,反正下面還有提純的方法。
另外溶劑在過柱子后最好也回收使用,一方面環保,另一方面也能節省部分經費,缺點
是要消耗一定的人工。這里要注意的是,一般在過柱同時進行的是減壓旋蒸,石油醚和
乙酸乙酯的比例由于揮發度的不同會導致極性的變化,一般會使得極性變大,在梯度淋
洗時比較合適,正好極性越來越大了。在過完柱子后,溶劑最后回收要采用常壓,因為
在減壓旋蒸時會有部分低沸點的雜質一起出來,常壓時就會減少這種現象,如果雜質和
你下面要過的樣品有反應那就慘了。

關于操作問題。

1 裝柱。
柱子下面的活塞一定不要涂潤滑劑,會被淋洗劑帶到產品中的,可以采用四氟節門的。
干法和濕法裝柱覺得沒什么區別,只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應該要適度的緊
密(太密了淋洗劑走的太慢),一定要均勻(不然樣品就會從一側斜著下來)。書中寫
的都是不能見到氣泡,我覺得在大多數情況下有些小氣泡沒太大的影響,一加壓氣泡就
全下來了。當然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練習了。但是柱子更忌諱的是
開裂,甭管豎的還是橫的,都會影響分離效果,甚至作廢!

2 加樣。
用少量的溶劑溶樣品加樣,加完后將下面的活塞打開,待溶劑層下降至石英砂面時,再
加少量的低極性溶劑,然后再打開活塞,如此兩三次,一般石英砂就基本是白色的了。
加入淋洗劑,一開始不要加壓,等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離(2~4cm就夠了)
,再加壓,這樣避免了溶劑(如二氯甲烷等)夾帶樣品快速下行。

3 淋洗劑的選擇。
感覺上要使所需點在rf0.2~0.3左右的比較好。不要認為在板上爬高了分的比較開,過
柱子就用那種極性,如果rf在0.6,即使相差0.2也不容易在柱子上分開,因為柱子是一
個多次爬板的狀態,可以通過公式的比較:0.6/0.8一次的分離度,肯定不如(0.2/0.3
)的三次方或四次方大。

4 樣品的收集。
用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。所以如果樣品與硅膠的吸附比
較強的話,就不容易流出。這樣就會發生,后面的點先出,而前面的點后出。這時可以
采用氧化鋁作固定相。
另外,收集的試管大小要以樣品量而定,特別是小量樣品,如果用大試管,可能一根就
收到了三個樣品,wuwu。如果都用小試管那工作量又太大。

5 最后的處理。
柱分后的產品,由于使用了大量的溶劑,其中的雜質也會累積到產品中,所以如果想送
分析,最好用少量的溶劑洗滌一下,因為大部分的雜質是溶在溶劑里的,一洗基本就沒
了,必要時進行重結晶。

實驗室常用的正向柱分離有加壓、常壓和減壓等,我原是做天然產物全合成的,也做過少量天然產物分離工作。還常用到反向柱。
正向柱分離
1。TLC
1)加壓、常壓柱
主點Rf 0。5左右,相近的組份要能分開。
2)減壓柱
主點Rf 0.1左右,相近的組份要能分開,或次組份在原點。
2.硅膠或氧化鋁等
1)加壓、常壓柱
60到200目
2)減壓柱
300目以上
大空樹脂挺好,但自己用得少。硅藻土很多時侯也很好。
3.柱徑
好分、量大,柱徑可大些;難分、量小,柱徑可小些。
4。柱長
與柱徑相似,好分、量大,柱長可短些。
5.制樣
減壓一般是干法拌樣;加壓、常壓可干法拌樣,也可濕法備樣。
6。洗脫液
老板科研經費多,用加壓、常壓耗溶劑太多;要想給老板省錢,給自己省時間,就用減壓。
7.接液
主點未出,多接;主點快出來及快出完,少接。
8。收率
對同一樣品且同量減壓一般收率低;加壓、常壓一般收率高。
9.備柱
無論減壓、加壓、常壓;無論干法、濕法備柱。填料要想法壓實,且備柱或過柱時均不可有氣泡、斷層、干柱(減壓除外。),否則一切從頭開始。

過硅膠柱的經驗

1 裝柱
裝柱子(添硅膠)時,常用的有兩種方法:即濕法裝柱和干法裝柱,二者各有優劣。

不論干法還是濕法,硅膠(稱為固定相更為廣義)的上表面一定要平整,并且硅膠(固定相)的高度一般為15cm左右(長度沒有絕對之說,根據自身情況而定,制備的大柱可以長達一米),太短了可能分離效果不好,太長了也會由于擴散或拖尾導致分離效果不好。

濕法裝柱是先把硅膠用適當的溶劑拌勻后,再填入柱子中,然后再加壓(土方法可以用養魚的氧氣泵加壓或是用氮氣,當然不加壓也可以)用淋洗劑"走柱子",本法最大的優點是一般柱子裝的比較結實,沒有氣泡。 (我一般都用濕法裝柱

干法裝柱則是直接往柱子里填入硅膠,然后再輕輕敲打柱子兩側(濕法也要敲的,效果好點),至硅膠界面不再下降為止,然后再填入硅膠至合適高度,最后再用油泵直接抽,這樣就會使得柱子裝的很結實(一般柱子不敢用油泵抽,怕把柱子抽裂了)。接著是用淋洗劑"走柱子",一般淋洗劑是采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。通常上面加壓,下面再用油泵抽,這樣可以加快速度。干法裝柱較方便,但最大的缺陷在于"走柱子"時,由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱(可以用手摸柱子明顯感覺到)(梯度洗脫時,濕法裝柱也會出現該情況,比較不好處理,可以緩慢改變溶劑,且置于通風處),容易產生氣泡,這一點在使用低沸點的淋洗劑時如乙醚(用乙醚最最明顯),二氯甲烷更為明顯。雖然產生的氣泡在加壓的情況下不易察覺,但是,一旦撤去壓力,如在上樣、加溶劑等操作的時候,氣泡就會釋放出來,嚴重時,整個柱子變花,樣品不可能平整地通過,當然也就談不上分離了。
解決的辦法是:
第一、硅膠一定要壓結實;
第二、 一定要用較多的溶劑"走柱子",一定要到柱子的下端不再發燙,恢復到室溫后再撤去壓力。  
也有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂(我一般墊張濾紙,撒上石英砂,再放些棉花),防止添加溶劑的時候,使得樣品層不再整齊。但我的感覺是如果小心上樣,添加溶劑,則沒有這個必要。

二、上樣

上樣也有干法和濕法之分:
干法(也稱硅膠制沙)就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后,在加入少量硅膠,拌勻后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩,但可以保證樣品層很平整。(我一般喜歡用這種方法,除非不能用

濕法上樣就是用少量溶劑(最好就是展開劑,如果展開劑的溶解度不好,則可以用一極性較大的溶劑,但必須少量)將樣品溶解后,再用膠頭滴管轉移得到的溶液,沿著層析柱內壁均勻加入。然后用少量溶劑洗滌后,再加入。

濕法較方便,但不溶劑讓其完全被硅膠均勻吸附,不容易跑的很平整

柱層析關鍵在于柱子是否裝好(這是最大影響因素)和淋洗劑是否選擇恰當。而淋洗劑的選擇則是通過TLC確定。這里要指出的一點是:TLC(作用還是很大的)的作用除了跟蹤反應進程,檢測試劑和原料純度外,一個重要的用途就是為柱層析選擇適當的淋洗劑。
上樣完畢后,接著即用淋洗劑淋洗。淋洗劑一般采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄板的不同,即使兩者使

用的硅膠都相同,但是在把TLC分析得到的展開劑用在柱層析時,也顯得極性偏大,所以要稀釋一倍,但又不能稀釋太多,否則成了靠擴散作用來分離,效果也不會好。(這一點很實用,不過有些特殊情況也不一定,如果要保險可以先做根小柱子跑一下,這樣最安全,就是花點時間


三、收集

主要依靠TLC(據說國外有石英柱,直接用熒光燈照能看出來,不過太貴了,在國內不一定適用),需要切記的是:

第一、某種樣品在這種展開劑中只顯示一個點,并不等于在別的展開劑中也只顯示一個點。因此在尋找展開劑時,多嘗試幾種比例不同,成分不同的展開劑。展開劑的極性太小,點分不開,極性太大,也分不開。一般以目標產物的Rf值在0。3左右為最佳。

第二、點不能點得太濃(在最后時應該點的濃點,這樣看看有無收盡產品),否則容易重疊,不易判斷,因為如果兩個點相近的話,一濃就變成一個點了。

第三、板上點的展開的清晰程度和溶劑的極性和物質在該溶劑中的溶解性有關,只有兩者比較合適才能有一個交好的分離效果。

選擇適當的展開劑是首要任務。一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為:石油迷<己烷<苯<乙醚 展開劑的比例要靠嘗試。

一般根據文獻(這是首選)中報道的該類化合物用什么樣的展開劑,就首先嘗試使用該類展開劑,然后不斷嘗試比例,直到找到一個分離效果好的展開劑。

很多時候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達到最佳效果。不行可以嘗試兩兩混合,三者混合,一般把兩種溶劑混合時,采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象,再調整比例,達到最佳效果,如果沒有分開的跡象,最好是換溶劑。

在利用TLC跟蹤反應時,在點板的時候往往是反應體系的混和溶液點一個點A,每種難揮發的原料各點一個點B,C, D等等,然后所有的原料和反應體系的混合溶劑再共同點 一個混合點X,這些點在板上的位置如圖所示: A X B C D
這樣的好處是展開后可以清楚地看見每個點的位置,把A這個點展開后的各個層份的 點與B,C,等原料比較,從而判斷原料消失沒有,點混合點X的目的在于,方便觀察,因為有時候,板展開后,各點的位置有些變形,或者由于邊緣效應等等,使得判斷不易。(用小板,跑的快,很快見到結果,為了避免小板的邊緣,用機器板較好

利用TLC判斷物質的純度時,如果不能完全確定,可以再結合其他檢測手段,如NMR,因為某種樣品在這種展開劑中只顯示一個點,并不等于在別的展開劑中也只顯示一個點。

但有趣的是,由于H-NMR可鑒別 的純度也就在95%左右,有時候H NMR現示較純的東西,一點板就會發現有幾個點。所以,兩者要結合使用。如果有標準品或是以前做過的,對個對照最方便。

反相色譜柱的使用與維護

反相柱填料主要以硅膠為基質,在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(ODS)稱為C18柱,其它常用的反相柱還有C8,,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱,GPC柱,聚合物填料柱等。本文重點介紹反相色譜柱的選擇和使用:
一、反相色譜柱的選擇
1.柱子的PH值使用范圍
   反相柱優點是固定相穩定,應用廣泛,可使用多種溶劑。但硅膠為基質的填料,使用時一定要注意流動相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8,流動相的PH值小于2時,會導致鍵合相的水解;當PH值大于7時硅膠易溶解;經常使用固定相要降解。一旦上述情況,色譜柱人口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。如果流動相PH較高或經常使用緩沖液時,建議選擇PH范圍大的柱子,例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。
2.填料的端基封尾(或稱封口)
   把填料的殘余硅羥基采用封口技術進行端基封尾,可改善對極性化合物的吸附或拖尾;含碳量增高了,有利于不易保留化合物的分離;填料穩定性好了,組分的保留時間重現性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物,最好選用填料經端基封尾的色譜柱。
二、液相色譜柱的使用
   色譜柱在使用前,最好進行柱的測試,并將結果保存起來,作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件),只有這樣,測得的結果才有可比性。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
a、最好使用流動相溶解樣品。
b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不 可逆吸附的雜質。
c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。
2、流動相的配制
   液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的,因此要求流動相具備以下的特點:
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
b、流動相與樣品不產學反應
c、流動相的黏度要盡量小,以便得到好的分離效果;降低柱壓降,延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器,最好使用對紫外較低的溶劑配制。
e、流動相沸點不要太低,否則容易產生氣泡,導致實驗無法進行。
f、在流動相配制好后,一定要進行。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測,還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。
3、流動相流速的選擇
   因柱效是柱中流動相線性流速的函數,使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱,要追求最佳柱效,最好使用最佳流速。對內徑為4。6mm的色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對于內徑為4。0mm柱,流速0。8ml/min為佳。
當選用最佳流速時,分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時,可適當增加或乙腈的含量)。
注意:
a.含水流動相最好在實驗前配制,尤其是夏天使用緩沖 溶液作為流動相不要過夜。最好加入疊氮化鈉,防止生長。
b.流動相要求使用0.45 μm濾膜過濾,除去微粒雜質。
c.使用HPLC級溶劑配制流動相,使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命,提高柱性能。
三. 色譜柱的維護
1. 色譜柱的平衡
   反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。 每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱,您就會在處理問題方面獲得最大的”補償”,而且您的色譜柱的壽命也會變得更長!操作步驟:
a。 平衡開始時將流速緩慢地提高,用流動相平衡色譜柱直到獲得穩定的基線(緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低,則需要較長的時間來平衡)
b。 如果使用的流動相中含有緩沖鹽,應注意用純水”過渡”即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡; 分析結束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。
2. 色譜柱的再生
   長期使用的色譜柱,往往柱效會下降(柱子的理論塔板數減低)。可以對色譜柱進行再生,在有條件的實驗室應使用一個廉價的泵進行柱子的再生。 
建議用來沖洗柱子的溶劑體積
色譜柱 柱體積 所用溶劑的體積
125-4mm 1。6ml 30ml
250-4 mm 3.2ml 60ml
250-10mm 20ml 400ml
選擇再生方法:
極性固定相(如Si,NH2* ,DIOL基色譜填料)的再生:
正庚烷→氯仿→乙酯→→水**
非極性固定相(如反相色譜填料RP-18,RP-8,CN等)的再生: 水→乙腈→氯仿(或異丙醇)→乙腈→水
注意:
a. 在對NH2改性的色譜柱進行再生時,由于NH2可能以銨根離子的形式存在,因此應該在水洗后用0.1M的氨水沖洗,然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。
b. 0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱,如果簡單的用有機溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質,在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
3。 色譜柱的維護
a.使用預柱保護分析柱(硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度)
b.大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2-7。5,盡量不超過該色譜柱的pH范圍
c.避免流動相組成及極性的劇烈變化
d.流動用前必須經脫氣和過濾處理
e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相,應在實驗完畢柱子沖洗干凈,并保存于甲醇或乙腈中
f.氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時要注意,柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑,以避免腐蝕。

葡聚糖凝膠柱的使用方法

葡聚糖凝膠柱的使用方法:
#?/_8\'O4@*K8`-Q植提之家,植提空間,中國植提論壇,植提論壇,植提網(1) 預處理 5%+G%M.c4^)S6S3r
   稱取Sephadex G-25(50-100目)約5g,加入蒸餾水100ml,置室溫下3h進行溶脹。5v7k&D*t(]3}
(2) 裝柱中國植提論壇|植提網!P3n%f)G-G0d
   凝膠層析柱的直徑與柱長之比一般為1:15。柱的底部用裝有細玻璃管的橡皮塞塞緊,用洗凈的玻璃絲(約200目尼龍布)墊底或購買類似規格的商品柱。然后將柱垂直安裝好,先加入1/3柱體積蒸餾水,接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊連續裝入,使它們在柱內自然沉降。同時大開下口慢速流出蒸餾水。裝柱后的凝膠必須均勻,不能有氣泡或明顯條紋。否則,必須到出重裝,裝好后,用蒸餾水平衡2-3h即可加樣品分離。
8H$F#V3c [(3) 加樣
$t.Z-X*D!W J&i    加樣前,首先把柱內凝膠上面多余的蒸餾水放出,直到柱內液面與凝膠表面相齊(或留一極薄液層)為止。然后,由柱的上端加水解液2ml,注意不要讓溶液把凝膠沖松浮起,加完樣品后,打開下口緩慢放出液體至液面與凝膠面相齊,再用少量蒸餾水沖洗原來盛樣品的容器2-3次,待全部進入層析柱后,即可進行洗脫。
6{&C!f4K1o9| ^中國植物提取物論壇(4) 洗脫與收集
)\.E"w+@&W)n$p+d P5D中國植物提取物論壇    洗脫時,用蒸餾水作洗脫劑,并且要連續不斷地進行,使凝膠柱上端保持一定的液層,防止凝膠柱表面的液體流干。本實驗洗脫液流出的速度應控制在0.8-1.0ml/min。洗脫液的收集采用分管連續順序收集,每管收集3ml,共收集10管。據經驗,4或5號管核苷酸濃度最大,可作為層析鑒定的樣品液。但因層析柱長度的差異,管號會有變化,必要時可用紫外檢測A260nm,找出濃度最大的管號。
'E*L)a(^7c,P(5) 凝膠的再生和回收
4f2{3]*{)o4d。u-j,V植提之家,植提空間,中國植提論壇,植提論壇,植提網    凝膠柱使用一次后,必須反沖疏松一次,平衡后再使用。若使用數次,就需要再生處理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡,然后用蒸餾水洗至中性備用。若實驗完畢,將再生后的凝膠在布氏漏斗上用蒸餾水洗滌抽干,再用95%乙醇洗兩次,在60烘箱中烘干,回收保存。植提之家,植提空間,中

葡聚糖凝膠柱使用及注意事項

吸附模式 取決于所需分辯率
分子量大小 小于總體積的20%
正相分配 小于總體積的1%
12.其他
膠粒形狀 球形,多孔
顆粒大小(干) 18-111um(直徑)
顆粒大小中間值(干) 70um(直徑)
顆粒大小(甲醇) 27-163 um(直徑)
顆粒大小中間值(甲醇) 103 um(直徑)
最大線性流速 720cm/min
參考線性流速 60 cm/min
pH的穩定性
操作中 2-11
清洗中 2-13
化學穩定性 在許多水溶液及有機溶劑系統中都穩定。在pH2以下或強氧化劑中不穩定
高壓滅菌 121℃可忍受20分種
操作溫度 4℃到40℃
保存條件
新填料 4-25℃(干燥)
使用后填料 4-8℃,pH6-8,切勿冷凍,加入抑菌劑(如20%乙醇,0。04%疊氮鈉)
13。干膠溶脹表
溶劑 床體積(mL凝膠/g干膠粉末)
Dimethyl sulphoxide 二甲亞砜 4。4~4。6
Pyridine 嘧啶 4.2~4.4
Water 水 4.0~4.4
Dimethylformamide 二甲基甲酰胺 3.8~4.2
Saline 生理鹽水 3.9~4.1
Methanol 甲醇 3.8~4.1
Methane dichloride 二氯乙烷 3.8~4.1
Chloroform* 氯仿 3。8~4。1
Propanol 丙醇 3.7~4.0
Ethanol** 乙醇 3.6~3.9
Isobutanol 異丁醇 3.6~3.9
Formamide 甲酰胺 3。6~3。9
Methylene dichloride 二氯甲烷 3。6~3。9
Butanol 丁醇 3。5~3。8
Isopropanol 異丙醇 3。3~3。6
Tetrahydrofuran 四氫呋喃 3.3~3.6
Dioxane 二氧雜環已烷 3。2~3。5
Acetone 丙酮 2.4~2.6
Acetonitrile*** 乙腈 2.2~2.4
Carbon tetrachloride 四氯化碳 1。8~2。2
Benzene 苯 1.6~2.0
Ethyl acetate 乙酸乙酯 1.6~1.8
Toluene 甲苯 1.5~1.6
*包含1%的乙醇
**包含1%的苯
***溶脹膠體積小于2.5mL/g的溶劑沒有使用價

凝膠色譜柱的使用方法

看到很多蟲友問葡聚糖凝膠的使用方法,所以將自己的一點經驗寫下來,以作參考。葡聚糖凝膠柱的使用方法大體有一下步驟:
(1) 預處理
稱取葡聚糖凝膠(有不同型號)若干克,加入洗脫劑(通常為甲醇或者水,這里以甲醇為例)約20倍凝膠量,置室溫下3h進行溶脹,溶脹必須徹底,否則會使上柱后流速變慢,凝膠斷裂等。
(2) 裝柱
凝膠層析柱的直徑與柱長之比一般為1:15。柱的底部用裝有細玻璃管的橡皮塞塞緊,用洗凈的玻璃絲(約200目尼龍布)墊底或購買類似規格的商品柱。然后將柱垂直安裝好,接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊緩緩連續裝入,色譜柱的出口流速m維持在5~10ml/min。凝膠顆粒沉積到柱底后關緊色譜柱,等沉降到1-2cm時再2打開色譜柱。直至降到滿意高度為止,等凝膠柱內的液體留的與凝膠高度差不多時,用較小的濾紙蓋住凝膠床表面,再用洗脫劑洗脫過夜。裝柱后的凝膠必須均勻,不能有氣泡或明顯條紋。否則,必須到出重裝。
(3) 加樣
裝好的色譜柱至少要用相當于3倍保留體積的洗脫劑平衡,待洗脫劑流至與凝膠柱液面相平時(不能流干,否則會帶入氣泡),用滴管吸取樣品溶液,在高于凝膠表面約1cm處,沿管壁四周緩緩滴加樣品液,加完后打開下面的出口,使樣品滲入凝膠內。再關閉出口,用少量洗脫液將管壁殘留的樣品洗下,再打開出口,至溶液滲入柱內,再關閉出口。可以考慮再加一層薄薄的脫脂棉以保護柱表面(我一般不加),然后即可進行洗脫。
(4) 洗脫與收集
洗脫時,用甲醇作洗脫劑,并且要連續不斷地進行,使凝膠柱上端保持一定的液層,防止凝膠柱表面的液體流干。一般酸性洗脫劑中堿性物質容易洗脫,堿性洗脫劑中酸性物質容易洗脫。多糖類物質等極性大的物質考慮用水洗脫,常用的洗脫劑是水-甲醇,水-乙醇,水-丙酮等,一般根據自己樣品的性質選擇洗脫液,洗脫液可一直用單一梯度。凝膠色譜的共性是流速慢,每份一般體積較小。(內徑1.3cm左右,長80cm左右的柱子我一般每份收集液為8ml)
(5) 凝膠的再生和回收
凝膠柱多次使用后,若污染嚴重,則考慮用50度左右的2%的NaOH和0.5mol/LNaCl混合液浸泡后,再用水洗凈即可。

凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)

凝膠過濾層析法又稱排阻層析或分子篩方法,主要是根據蛋白質的大小和形狀,即蛋白質的質量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質,多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質,使蛋白質混合物中的物質按分子大小的不同進行分離。
也叫做分子排阻層析(molecular-exclusion chromatography)。一種利用帶孔凝膠珠作基質,按照分子大小分離蛋白質或其它分子混合物的層析技術。 一般是大分子先流出來,小分子后流出來。

凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用,根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質,多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質,小分子物質能進入其內部,流下來速度慢,而大分子物質卻被排除在外部,下來的速度快,當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時,溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
它的突出優點是層析所用的凝膠屬于惰性載體,不帶電荷,吸附力弱,操作條件比較溫和,可在相當廣的溫度范圍下進行,不需要有機溶劑,并且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對于高分子物質有很好的分離效果。

凝膠過濾層析技術原理講解

凝膠過濾層析(Gel Filtration Chromatography,GFC)又稱

尺寸排阻層析(Size Exclusion Chromatography,SEC)

凝膠滲透層析(Gel Permeation Chromatography,GPC)

分子篩層析(Molecular Sieve Chromatography,MSC)


注:在高效液相色譜分析中,用GFC或SEC表示凝膠過濾色譜或尺寸排阻色譜,流動相通常是水溶液;在有機高分子分析中,常用GPC表示凝膠滲透色譜,流動相通常是有機溶劑;在蛋白質分離純化中用GFC或SEC表示凝膠過濾層析或尺寸排阻層析;本文以下內容均針對蛋白質分離,因此均以凝膠過濾層析(GFC)表示。

(1)分離機理

GFC填料是由高分子交聯而成、內部具有網狀篩孔的固體顆粒,利用球狀凝膠內的篩孔的大小,不同水力學半徑的分子在通過填料時運行路徑存在差異,利用該差異將不同大小的蛋白質進行分離。
蛋白質分子流過填充凝膠的管柱時,大分子無法進入凝膠篩孔,而只流經凝膠及管柱間的孔隙,因此總體運行路徑較短,從層析柱入口到出口所需時間較短;較小的分子因為進入凝膠內的篩孔,總體運行路徑較長,故在管柱內的停留時間較長;基于此原理可以區分大小不同的分子,亦可與已知大小的分子作比較而確定未知樣品的分子量。

注1:球形蛋白與線性分子在凝膠過濾層析中的保留行為存在差異,因此使用球形蛋白制作的分子量標準曲線不能用于明膠多肽、淀粉或其它聚合物。





(2)應用范圍

A蛋白質分離,基于混合中不同蛋白質分子尺寸大小進行分離;

B分子量測定,蛋白質分子量(球形)的對數與其在凝膠過濾層析時的保留時間呈線性關系;

C樣品脫鹽或溶劑置換。


(3)填料要求
一般狀況下,用于制備凝膠過濾層析的填料應不吸附目標成份,所有欲分離物質均被洗脫出,這是凝膠層析法與其它層析法不同的地方。凝膠的材質需為化學惰性,與分離物不能產生變性(denature)或是其它化學反應,最好具有能長期反復使用的穩定性,并可以在較大的pH和溫度范圍內使用。凝膠要有一定的機械強度,在層析過程中才不會變形,增加機械強度也可使層析在較高壓力的環境進行,縮短分離時間。

(4)凝膠過濾常用填料種類


目前常用的凝膠包括3個主要類型:
A:葡聚糖凝膠(Polydextran),商品名稱是Sephadex
Polydextran幾乎不溶于溶劑中,親水性強,能迅速在水和電解質溶液中膨脹,在堿性的環境中十分穩定,所以可以用堿去除凝膠上的污染物。
Sephadex G-X,X表示葡聚糖的交聯程度,數值越大則交聯度越小,但吸水量越高,X值大致是吸水量的10倍。以Sephadex G-25為例,表示1克干燥的G-25凝膠可以吸水2.5 ml。
Sephadex的分離范圍與填料粒經和交聯度密切相關,大概范圍如下:
型號
粒度(微米)
有效分離范圍(球形蛋白質)
G 10
55-166
<700
G 15
60-180

<1500
G 25
-
1000-5000
G 50
-
1500-30000
G 75
-
3000-80000
G 100
-
4000-150000
G 150
-
5000-300000
G 200
-
5000-600000

Superdex屬于葡聚糖以共價結合到交聯多孔瓊脂糖珠體上的球形凝膠,流速快、反壓低。
型號
粒度(微米)
有效分離范圍(球形蛋白質)
Superdex 30
24-44
<10000
Superdex 75
24-44
3000-70000
Superdex 200
10000-600000

B 聚丙稀酰胺凝膠(Polyacrylamide)
Polyacrylamide是一種合成凝膠,商品名Bio-Gel P,干粉顆粒狀。依膠的分離范圍不同,分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300,P后面的數字乘以1000為最大過濾限度。Polyacrylamide的化學性質不活潑,但它在極端的pH下會被水解,水解后產生的COOH-具有離子交換的性質,因此pH值應盡量控制在2-10之間。
型號
粒度(微米)
有效分離范圍(球形蛋白質)
Bio-Gel P-2
-
<1800
Bio-Gel P-4
-
800-4000
Bio-Gel P-6
-
1000-6000
Bio-Gel P-10
-
1500-20000
Bio-Gel P-30
-
2500-40000
Bio-Gel P-60
-
3000-60000

C 瓊脂糖凝膠
商品名稱Sepharose,由屬于天然凝膠,依凝膠中干膠的百分含量,分為Sepharose 2B,4B和6B。Agarose gel是一種大孔凝膠,主要用于像核酸或病毒這些分子量400,000以上的物質,因其顆粒軟,在分離過程有時會阻塞管柱,造成流速減慢,又因其在攝氏50度以上會融化,故需于較低溫的環境中進行層析。Agarose做成beads后不能再脫水干燥,所以要在濕態中保存。
經2,3-二溴丙醇反應交聯而成的凝膠為Sepharose CL型凝膠
型號
粒度(微米)
有效分離范圍(球形蛋白質)

Sepharose 2B
70000-40000000

Sepharose 4B
60000-20000000

Sepharose 6B
10000-4000000

Sepharose CL-2B
70000-40000000

Sepharose CL-4B
60000-20000000

Sepharose CL-6B

10000-4000000

Superpose瓊脂糖經多次交聯形成的凝膠。


型號
粒度(微米)
有效分離范圍(球形蛋白質)

Superose 6
5000-5000000

Superose 12
1000-300000

其它凝膠:聚丙稀酰胺葡聚糖凝膠,交聯聚苯乙烯凝膠,聚乙烯醇凝膠等,還有更多新型號的凝膠。


4 操作實例(轉載)
1) 凝膠溶脹
凝膠顆粒要求大小比較均勻
,可流速穩定,結果較好。取葡聚糖Sephardex G-75干粉,加過量的蒸餾水室溫充分溶脹一天(溶脹時間因凝膠交聯度不同而不同),或沸水浴中溶脹3小時,這樣可大大縮短溶脹時間,而且可以殺死細菌和霉菌,并可排出凝膠內氣泡。溶脹過程中注意不要過分攪拌,以防顆粒破碎。待溶脹平衡后用傾瀉法除去不易沉下的細小顆粒,最后凝膠經減壓抽氣除去氣泡,即可準備裝柱。

色譜分離技術
4[7P'D%d:o/~$N9k中國植物提取物論壇      色譜分離技術又稱層析分離技術或色層分離技術,是一種分離復雜混合物中各個組分的有效方法。它是利用不同物質在由固定相和流動相構成的體系中具有不同的分配系數,當兩相作相對運動時,這些物質隨流動相一起運動,并在兩相間進行反復多次的分配,從而使各物質達到分離。
8G)W;]1j3T"j1Z's:J8{      色譜有多種,按固定相類型和分離原理可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、親和色譜、大孔吸附樹脂、凝膠色譜、聚焦色譜等。最常用的是吸附色譜分離技術。
     吸附色譜法是指混合物隨流動相通過吸附劑(固定相)時,由于吸附劑對不同物質具有不同的吸附力而使混合物中各組分分離的方法。此法特別適用于脂溶性成分的分離。被分離的物質與吸附劑、洗脫劑共同構成吸附層析的三要素,彼此緊密相連。
+\(f4N9{ W4T中國植物提取物論壇      常用的極性吸附劑有:硅膠、氧化鋁。硅膠顯弱酸性,適于分離酸性和中性化合物,分離生物堿時需在流動相中加入適量的有機堿;氧化鋁呈堿性,適于分離生物堿等堿性成分,不宜用于分離有機酸等酸性成分。極性吸附劑的吸附作用有以下特點。 Y!s+i0C,S%j&p#I#p$O,E
     1.被分離物質極性越強,吸附力越強。強極性溶質將優先被吸附。植提之家,植提空間,中國植提論壇,植提論壇,植提網'_1i,~+u9Y7^'|:G8f
     2.溶劑極性越弱,則吸附劑對溶質的吸附能力越強。隨溶劑極性的增強,則吸附劑對溶質的吸附力將減弱。www。plantextra。com$~)m7O0z。O&r
     3.當加入極性較強的溶劑后,先前被硅膠或氧化鋁所吸附的溶質可被置換而洗脫出來。中國植提論壇|植提網7w5c5c-j7W%N1P.Y
     活性炭是常用的非極性吸附劑。活性炭對非極性物質具有較強的親和力,在水中對溶質表現出強的吸附能力。從活性炭上洗脫被吸附的物質時,溶劑的極性越小,洗脫能力越強。中國植提論壇|植提網"V:|2A9]'f.z!H4M;c(P1l'G!r
     一般化合物的極性按下列官能團的順序增強:
8\9S-k"_/K8^中國植物提取物論壇        —CH2—CH2—,—CH==CH—,—OCH3,—COOR,>C==O,—CHO,—NH2,—OH,—COOH。*g1o9r4Z&F!t8V
    溶劑的極性可大體根據介電常數的大小來判斷。介電常數越大,則極性越大。一般溶劑的介電常數按以下順序增大:環已烷(1.88),苯(2.29),無水乙醚(4.47),              中國植提論壇|植提網/j6A(p*Q$p)a.E
     氯仿(5.20),乙酸乙酯(6.11),乙醇(26.0),甲醇(31.2),水(81.0)。:L.b(A6X2F&s#C
     吸附色譜的操作方式主要有薄層色譜法和柱色譜法。薄層色譜法是將吸附劑均勻鋪在玻璃上,點樣,然后用合適的展開劑展開而達到分離、鑒定和定量的目的。柱色譜是將待分離的樣品均勻加入到裝有固定劑填料的柱子內,再以適當的洗脫劑洗脫以達到不同成分的分離。 ^6W$\+c;v&q
     色譜分離技術常用于功能性的分離精制。例如,從茶葉中提取茶多酚時可采用層析法分離除去咖啡因及其他不純物;從橘皮的超臨界萃取液中分離提取類胡蘿卜素;從芝麻粕提取液中分離提取木聚糖;從蔗糖的酶處理液中分離精制低聚果糖;從牛初乳中分離提取乳鐵蛋白;從磷蝦酶解殘渣抽提液中分離提取蝦黃素、卵磷脂等。